Цей перший випадок генетичної маніпуляції з ящіркою створив модельний організм, який міг би допомогти отримати подальше розуміння еволюції та розвитку рептилій.
CRISPR-Cas9 або просто CRISPR є унікальним, швидким і недорогим ген інструмент редагування, який дозволяє редагувати геном шляхом видалення, додавання або зміни ДНК. Абревіатура CRISPR розшифровується як «Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats». Цей інструмент простий і точніший, ніж попередні методи редагування ДНК.
Інструмент CRISPR-Cas9 вводить організмам на стадії зиготи (одноклітинної) конструкцію ДНК з (а) ферменту Cas9, який діє як «ножиці» і може розрізати або видаляти частину ДНК, (b) направляє РНК – послідовність, яка відповідає цільовому гену і таким чином спрямовує фермент Cas9 до цільового місця. Після того, як цільова ділянка ДНК буде розрізана, механізм репарації ДНК клітини знову приєднається до ланцюга, що залишився, і в цьому процесі заглушить цільовий ген. Або ген можна «виправити» за допомогою нової модифікованої ДНК-матриці в процесі, який називається репарацією, спрямованою на гомологію. Таким чином, інструмент CRISPR-Cas9 дозволяє проводити генетичні модифікації шляхом ін’єкції редагування генів розчинів в одноклітинну запліднену яйцеклітину. Цей процес викликає генетичні зміни (мутації) у всіх наступних клітинах, які утворюються, таким чином впливаючи на функцію гена.
Хоча CRISPR-Cas9 зазвичай використовується для багатьох видів, включаючи риб, птахів і ссавців, поки що він не був успішним у генетичних маніпуляціях з рептиліями. Це пов’язано насамперед із двома перешкодами. По-перше, самки рептилій зберігають сперму на тривалий термін у своєму яйцепроводі, що ускладнює визначення точного часу запліднення. По-друге, фізіологія яєць рептилій має багато особливостей, таких як гнучка яєчна шкаралупа, крихкість без повітряного простору всередині, що ускладнює маніпулювання ембріонами, не викликаючи розриву або пошкодження.
У статті, завантаженій на bioRxiv 31 березня 2019 року дослідники повідомили про розробку та тестування способу використання CRISPR-Cas9 редагування генів у рептилій вперше. Вид рептилій, обраний у дослідженні, був тропічним ящірка званий Аноліс сагрейський або частіше коричневий анол, який широко поширений в Карибському басейні. Ящірок у дослідженні було зібрано з дикого регіону у Флориді, США. Цей вид ідеально підходить для дослідження через його мініатюрні розміри, тривалий період розмноження та відносно короткий середній час між двома поколіннями.
Щоб подолати обмеження, з якими зараз стикаються рептилії, дослідники мікроін’єктували компоненти CRISPR у незрілі незапліднені яйця, поки яйця ще були в яєчниках самок ящірок до запліднення. Вони націлені на ген тирозинази, який виробляє фермент, який контролює пігментацію шкіри у ящірок, і якщо цей ген видалити, ящірка народиться альбіносом. Цей чіткий фенотип пігментації став причиною вибору гена тирозинази. Потім мікроін’єкційні яйцеклітини дозрівають всередині самки і згодом природним чином запліднюються введеною чоловічою або збереженою сперматозоїдом.
У результаті через кілька тижнів народилося чотири ящірки-альбіноси, що підтверджує, що ген тирозинази був деактивований і редагування генів процес пройшов успішно. Оскільки нащадки містили відредагований ген від обох батьків, було зрозуміло, що компоненти CRISPR залишалися активними набагато довше в незрілому ооциті матері, а після запліднення він мутував батьківські гени. Таким чином, мутантні ящірки-альбіноси демонстрували змінену тирозиназу в генах, успадкованих як від матері, так і від батька, оскільки альбінізм є ознакою, успадкованою від обох батьків.
Це перше в історії дослідження з ефективного виробництва генетично модифікованих рептилій. Дослідження могло б працювати подібним чином на інших видах ящірок, таких як змії, для яких нинішні підходи досі були невдалими. Ця робота може допомогти отримати подальше розуміння еволюції та розвитку рептилій.
***
{Це дослідження наразі подано на експертну оцінку. Ви можете прочитати попередню версію, натиснувши посилання DOI, наведене нижче в списку цитованих джерел(-ів)}
Джерела
Расис AM та ін. 2019. Препринт. CRISPR-Cas9 Редагування генів у ящірок через мікроін'єкцію незапліднених ооцитів. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
